Otra mirada
Regeneración de la piel con PRP-(HA) Proyectos de investigación traslacional en Suiza, de los experimentos in vitro e in vivo a las pruebas clínicas.
Dr. Ali Modaressi, MD (1)
Sarah Berndt, PhD (2)
1. Cirugía plástica, reconstructiva y estética, Ginebra (Suiza)
2. Doctor en Ciencias Biomédicas y Farmacéuticas
Jefe de Investigación de Terapia Celular en Regen Lab AG (Suiza)
1. Investigación en terapia celular :
El objetivo de la terapia celular es introducir nuevas células sanas en el cuerpo del paciente para sustituir las células dañadas.
- Este tipo de terapia es un reto porque requiere un número suficiente de células para ser trasplantadas al paciente.
- Las células especializadas, como los fibroblastos o las células cerebrales, son difíciles de obtener del cuerpo humano.
- Además, las células especializadas suelen tener una capacidad limitada de multiplicación, lo que dificulta la producción del número de células necesario para algunas terapias celulares.
Algunos de estos problemas pueden resolverse mediante el uso de células madre.
- Células madre son células no especializadas que tienen la capacidad de convertirse en otros tipos de células funcionales.
- Es importante señalar que algunos tipos de células madre pueden ser cultivado fuera del cuerpo humanoEsto permite la producción de un gran número de células necesarias para el éxito de las aplicaciones de terapia celular en medicina.
- Cuando se utilizan células autólogas, el paciente es dueño de su propia terapia.
2. Demostración de la seguridad y la eficacia en proyectos de investigación traslacional: establecimiento de modelos de cultivo de células 100% autólogas.
En los últimos años, hemos iniciado un proyecto de investigación traslacional que ha demostrado el efecto proliferativo del PRP obtenido de la sangre del paciente sobre las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (ADSCs) y los fibroblastos del mismo paciente [1-3] (Figura 1).
- Nuestro objetivo es ser totalmente autólogos para ofrecer terapias personalizadas.
- Por eso se ha desarrollado una gama de productos sanitarios, CuteCell, dedicada al cultivo in vitro de células humanas en laboratorios de investigación (instalaciones GMP).
- Estos dispositivos permiten la preparación de PRP (CuteCell-PRP), suero (CuteCell-serum) y PRP enriquecido con MNC (CuteCell-MNC).
- Estos nuevos productos ofrecen una alternativa autóloga al suero fetal bovino (FBS) en los medios de cultivo para terapias celulares [4].
2.1 Células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (ADSC)
El PRP acelera la expansión de las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (ADSC).
- Con el fin de definir un sistema autólogo para la proliferación de las ADSC, evaluamos la eficacia del PRP autólogo en la proliferación de las ADSC en comparación con el medio convencional suplementado con FBS.
- Estudiamos la concentración óptima de PRP en los medios de cultivo.
- Los medios de cultivo complementados con 20% de PRP preparado a partir de la sangre del paciente aumentaron la proliferación in vitro de las ADSC en 14 veces en comparación con el medio de cultivo convencional preparado con 10% de FBS durante 10 días [1] (Figura 2).
Figura 2: El medio de cultivo complementado con PRP autólogo aumenta significativamente la proliferación in vitro en comparación con el medio de cultivo convencional que contiene 10% FBS. Datos de Atashi et al. Tissue Engineering. Parte C. 2014 [1].
El PRP no altera el fenotipo de las ADSC, su capacidad de diferenciación o su estado cromosómico.
- Comprobamos que el potencial intrínseco de diferenciación de las ADSC en adipocitos, osteocitos o condrocitos se mantenía intacto, independientemente de los suplementos utilizados para su proliferación.
- Observamos que el PRP no tenía un efecto negativo sobre la capacidad de diferenciación de las ADSC.
- Se confirmaron los potenciales de diferenciación adipogénica, condrogénica y osteogénica, que fueron cualitativamente comparables a los del FBS a 10% [1].
- El análisis citogenético de las células cultivadas en condiciones 10% FBS o 20% PRP no mostró un cariotipo anormal.
- Las condiciones de cultivo FBS y PRP mostraron estabilidad numérica y estructural.
Así, el tratamiento de las células con PRP no altera la estabilidad cromosómica [1].
2.2. Fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) :
En la actualidad, la aplicación de fibroblastos autólogos para la reparación de la piel reviste un gran interés clínico.
En la mayoría de los casos, es obligatorio el cultivo in vitro de células de la piel.
Sin embargo, la expansión celular utilizando medios de cultivo xenogénicos o alogénicos tiene algunas desventajas, como el riesgo de transmisión de infecciones o la lenta expansión celular.
2.2.1. Expansión mejorada de los fibroblastos con el tratamiento con PRP autólogo.
En este estudio, recogimos fibroblastos y sangre de los mismos pacientes.
- Tras 7 días de cultivo, los fibroblastos suplementados con diferentes concentraciones de PRP mostraron un mayor número de células viables en comparación con los medios que contenían FBS (Figura 3).
- Este efecto proliferativo del PRP siguió una curva en forma de campana dependiente de la dosis.
- La condición óptima de cultivo fue PRP 20%, donde el número de NHDF fue 7,7 veces mayor que FBS 10% [2,3].
Figura 3: Fotografía óptica de campo claro de NHDF en presencia de FBS 10% o PRP (5-20%) tras 7 días de cultivo. Aumento 10x. Las fotos son representativas de un solo donante. Datos de Berndt et al. Tissue Engineering. Parte A. 2019 [3].
2.2.2. La concentración óptima de PRP es crucial para el mantenimiento del fenotipo de los fibroblastos.
- Los fibroblastos cultivados en un medio de cultivo convencional suplementado con FBS mostraron una forma celular regular y aplanada,
- mientras que las tratadas con PRP (10-50 %) eran fusiformes, una morfología más parecida a los cultivos de matriz 3D o al contexto in vivo.
Investigamos si el cambio morfológico tras 7 días de tratamiento con PRP estaba relacionado con un cambio fenotípico.
- En primer lugar, demostramos una reorganización significativa de la actina F desde la localización cortical de la actina (FBS 10 %) hasta los filamentos gruesos que cruzan las células (PRP 20 %).
- A continuación, evaluamos los cambios en la expresión de alfa-SMA tras el tratamiento con PRP mediante citometría de flujo y análisis de inmunofluorescencia.
- La expresión de la alfa-SMA aumentó significativamente con una alta concentración de PRP (40-50%), mientras que las células tratadas con FBS-10% y PRP 5-10% mostraron una tinción perinuclear basal.
- El análisis de inmunofluorescencia mostró un aumento de la tinción de vimentina en presencia de PRP a 20 %, pero quedó completamente abolida a una alta concentración de PRP (PRP a 50 %) [3].
Estos resultados subrayan la importancia de una concentración óptima de PRP. Confirman que una alta concentración de plaquetas no es mejor que una concentración moderada y podría incluso ser perjudicial [5,6].
2.2.3. CuteCell PRP modula la actividad metabólica, la adhesión de los fibroblastos y promueve la migración.
Utilizando un ensayo metabólico MTT, demostramos un aumento en las células tratadas con PRP.
Esto refleja directamente un aumento de la actividad metabólica de las células, que alcanza un máximo de 3,12 veces en las células tratadas con PRP 20%, en comparación con las células tratadas con FBS 10% tras 48 h de tratamiento.
Para caracterizar aún más los efectos biológicos del PRP en la biología de los fibroblastos, evaluamos el efecto del tratamiento con PRP en la adhesión celular a la laminina y al colágeno de tipo I.
- El PRP disminuyó la adhesión global de los fibroblastos a la laminina 4 h después de la siembra.
- Este efecto se produjo ya después de 15 minutos, con una disminución de 21% en la adhesión celular global.
- Se obtuvieron los mismos resultados para la adhesión de los fibroblastos a la matriz de colágeno I (41% de adhesión celular total después de 15 min).
Para estudiar las propiedades migratorias de los fibroblastos expuestos al PRP, realizamos un ensayo de rascado in vitro (Figura 4).
- Ocho horas de tratamiento con 20% de PRP indujeron un aumento de 10% en el número de células que migraban desde el margen del arañazo a la zona del arañazo en comparación con los cultivos celulares con FBS. Este frente de migración era una migración celular colectiva.
- En cambio, los fibroblastos expuestos a 10 % de FBS mostraron características de migración celular aislada [3].
Figura 4: Efectos celulares comparativos del tratamiento PRP 10% sobre la migración celular en cultivos de fibroblastos. (A) Los fibroblastos migrantes redujeron la anchura de la zona de rascado, como se muestra en la tinción de inmunofluorescencia con faloidina después de 8 horas. El frente de migración celular se distribuye uniformemente a lo largo del borde del rayado en FBS 10%, mientras que es menos homogéneo en las células tratadas con PRP 10%. (B) Imágenes ampliadas que muestran la migración celular aislada en los cultivos FBS 10% y la migración celular colectiva en los cultivos PRP 10%. Datos de Berndt et al. Tissue Engineering. Parte A. 2019 [3].
2.2.4 Análisis de todo el genoma para demostrar que el CuteCell PRP es seguro a nivel genómico.
Para documentar la estabilidad genética durante la proliferación, cultivamos las NHDF durante 4 días con medios suplementados con FBS 10 % o PRP 10 %.
El análisis CGH de las células tratadas con los dos medios de cultivo diferentes no mostró ningún reordenamiento cromosómico desequilibrado.
El aumento de la tasa de proliferación en respuesta al tratamiento con PRP no produjo inestabilidad genómica [3].
Estos resultados son de importancia primordial, ya que algunos estudios afirman que los factores de crecimiento liberados por el PRP pueden contribuir a la progresión del tumor [7].
3. La angiogénesis es modulada diferencialmente por las preparaciones derivadas de las plaquetas
En el contexto de la regeneración tisular, la angiogénesis terapéutica tiene como objetivo restaurar un sistema vascular adecuado mediante la administración de factores de crecimiento exógenos, citocinas y quimiocinas, entre otros.
Los factores angiogénicos importantes son:
- VEGF,
- angiopoyetina,
- el FGF,
- el HGF,
- el PDGF
- y TGF
- aunque también se sabe que una miríada de otras proteínas participan en la formación de los vasos sanguíneos.
La liberación de productos derivados de las plaquetas, como factores de crecimiento autólogos, citocinas y quimiocinas, puede desencadenar la angiogénesis terapéutica.
En un estudio in vitro, evaluamos y comparamos la capacidad de tres preparaciones derivadas de plaquetas:
- plasma rico en plaquetas (PRP),
- Ácido hialurónico PRP (PRP-HA)
- y lisados de plaquetas (PL) a diferentes concentraciones (5-40%) para modular los efectos biológicos de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en el metabolismo,
- viabilidad,
- senescencia,
- la secreción de factores angiogénicos
- y la capacidad angiogénica 2D (prueba de formación de tubos endoteliales o EFTA)
- y 3D (prueba de cuentas de fibrina o FBA) [8].
3.1. El PRP y el PRP-HA modulan las actividades angiogénicas de las células endoteliales (HUVEC) en 3D.
En este trabajo, utilizamos un ensayo de angiogénesis 3D in vitro de alto rendimiento (el ensayo de cuentas de fibrina o FBA) para modelar el efecto angiogénico de las preparaciones derivadas de las plaquetas utilizadas en estudios de ingeniería de tejidos o en la clínica (Figura 5A).
- Probamos una gama de concentraciones (5 a 40 %) de la PRP estandarizada de CuteCell, CM-PRP-HA, obtenida con el tubo BCT-HA de Cellular Matrix, y una preparación comercial de lisados de plaquetas. Las muestras de sangre se obtuvieron de donantes sanos.
- El procedimiento se ajustó a los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por la Comisión Cantonal de Ética e Investigación de Ginebra (ID 2017-00700, aprobado el 18 de octubre de 2018).
- El BAF utiliza un cultivo de células endoteliales (CE) en la superficie de microesferas de Cytodex-3 de un tamaño de ~200 μm incrustadas en una matriz de fibrina bovina en 3D, con fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) utilizados como células alimentadoras.
- Estas células estromales proporcionan varios factores de crecimiento angiogénicos:
- factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF),
- factor de crecimiento transformador alfa (TGF-α),
- angiopoyetina-1 (Ang-1),
- así como las moléculas de la matriz,
- proteínas modificadoras de la matriz de las proteínas matricelares, por ejemplo
- potenciador de la endopeptidasa del procolágeno C 1,
- proteína ácida rica en cisteína secretada (SPARC),
- factor de crecimiento transformador-β (βIgH3) inducido por la proteína Ig-H3
- y la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 7 (IGFBP7)). [9].
En condiciones de control, la germinación de los neovasos es evidente entre los días 2 y 3, y los cultivos se visualizan en el día 4.
- Para la cuantificación del brote de microvasos, las muestras se escanean automáticamente con un generador de imágenes de alto rendimiento y el análisis de las imágenes de las microesferas se realiza mediante un método que hemos desarrollado con el software ImageJ (Figura 5B) [10,11].
- Este ensayo representa una mejora significativa con respecto a los ensayos convencionales de angiogénesis de una sola célula, ya que la inclusión de múltiples tipos de células imita más de cerca el entorno fisiológico [9].
- Los pasos básicos de la angiogénesis germinal incluyen
- la degradación enzimática de la membrana basal de los capilares,
- la proliferación de las células endoteliales (CE), la migración dirigida de las CE,
- tubulogénesis (formación de tubos por parte de las CE),
- la fusión de los vasos,
- poda de vasos
- y la estabilización de los pericitos.
- Las preparaciones derivadas de las plaquetas provocan diferentes respuestas angiogénicas cuando se prueban en el BAF, donde actúan en diferentes etapas del proceso angiogénico.
- Utilizando el potente método de cuantificación automática que hemos desarrollado [10], podemos evaluar la modulación de los parámetros morfométricos de los neovasos formados en la matriz de fibrina.
- Estos incluyen la longitud total de la red microvascular, las anastomosis en los vasos (ramas), el número de capilares que surgen de las protuberancias (anclaje) y el número de puntas de vasos que muestran la complejidad de la red (extremos) (Figura 5B).
- En nuestro estudio, los preparados más potentes fueron el PRP y el CM-PRP-HA, ya que la longitud total de la red neovascular, la longitud total de las ramas, las puntas y el anclaje se vieron fuertemente estimulados en comparación con las condiciones de control (tratamiento con VEGF+/heparina) (Figura 5C).
Las preparaciones de plaquetas estimularon todas las etapas del proceso angiogénico, y la microscopía de luz mostró el brote masivo de una red ramificada de microvasos (Figura 5A).
El PRP fue la preparación angiogénica más potente, estimulando significativamente la angiogénesis entre 2 y 12 veces, dependiendo de la concentración de PRP utilizada y del parámetro de interés (Figura 5C).
- Ya se observó una angiogénesis significativa con la concentración más baja de PRP (5 %).
- El CM-PRP-HA también estimuló la angiogénesis, pero en menor medida que el PRP: esto puede explicarse por el hecho de que la concentración de plaquetas en este preparado es la mitad que la del PRP.
- Los lisados de plaquetas debían estar muy concentrados para provocar la misma respuesta angiogénica que el PRP y el CM-PRP-HA [8].
Figura 5: Los productos derivados de las plaquetas modulan de forma diferencial la angiogénesis en el ensayo de cuentas de fibrina en 3D.
- (A) Los cultivos 3D de HUVECs fueron tratados con productos derivados de las plaquetas (PRP, PRP-HA y PL) a diferentes concentraciones durante 4 días. Imágenes representativas de un aumento masivo de la angiogénesis (PRP 20, PRP-HA 20) o de una leve proliferación endotelial a partir de perlas recubiertas de CE (PL20) en comparación con las condiciones de control (control y heparina) en el día 4. Barra de escala: 150 μm.
- (B) Imágenes representativas de la angiogénesis mejorada. Perlas de microtransporte Cytodex recubiertas con HUVECs que muestran el crecimiento pseudocapilar tras el análisis automático con un plugin específico desarrollado para el software Image J [11]; se indican algunos de los parámetros morfométricos de interés.
- (C) La cuantificación de los parámetros morfométricos de la red capilar se llevó a cabo mediante un método computarizado (utilizando el software de código abierto Image J) en fotos tomadas el día 4.
- Los parámetros representativos medidos fueron la longitud total, la longitud total de las ramas, el número de extremos y el número de uniones de anclaje por esfera.
Datos de Berndt et al. Biomedicines. 2021 [8].
3.2 Efecto sobre la viabilidad y senescencia de las HUVEC.
Para evaluar la viabilidad celular, añadimos violeta de cristal como tinción para estudiar el efecto de los productos derivados de las plaquetas en la viabilidad celular (Figura 6C).
- Después de 3 días de tratamiento, se encontraron más células moradas viables en los cultivos tratados con PRP y PRP-HA.
- La PRP y la PRP-HA (10-40 %) aumentaron la viabilidad de las células de forma dependiente de la dosis en comparación con las condiciones de control.
- El LP también aumentó la viabilidad celular, pero en menor medida [8].
- Para evaluar el efecto de las preparaciones derivadas de las plaquetas sobre la senescencia de las HUVEC, inducimos el envejecimiento in vitro cultivando las células a baja densidad [12] desde los pasajes 2 a 6.
- El envejecimiento in vitro induce un aumento del tamaño de las células y de los núcleos, y aparecen más células apoptóticas [13].
- En este ensayo, probamos 10% de FBS, 2IU/mL de heparina, 10% de PRP, 10% de PRP-HA y 10% de PL.
Los cultivos seriados a largo plazo en medios con FBS o heparina indujeron células senescentes, mientras que no se observaron células senescentes con los tratamientos derivados de las plaquetas [8].
Figura 6:
A. Viabilidad de las HUVECs evaluada mediante tinción con violeta de cristal en cultivos de control y en cultivos tratados con PRP, PRP-HA y PL.
B. Cuantificación de la cantidad de colorante liberado mediante la medición de la absorbancia (590 nm).
C. Tinción de beta-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-gal) de HUVECs (objetivos 20x) en el paso 6 tratadas con FBS, heparina, 10 % de PRP, 10 % de PRP-HA o 10 % de PL como se indica en las figuras.
Las células beta-gal positivas aparecen de color azul en condiciones de cultivo con FBS y heparina.
4. Conclusiones
La medicina regenerativa abarca un amplio abanico de técnicas destinadas a reparar o incluso sustituir tejidos dañados o envejecidos. De ellos, el plasma autólogo rico en plaquetas es uno de los más sencillos y eficaces. Este enfoque se basa en la capacidad intrínseca del cuerpo humano para repararse a sí mismo y en el papel de las plaquetas en este proceso.
Existe un creciente interés por el uso de PRP estandarizado, solo o en combinación, en la medicina regenerativa, ya que representa un tratamiento seguro y natural y hasta ahora ha mostrado resultados prometedores en muchas indicaciones terapéuticas.
En estudios clínicos, la administración de PRP ha mostrado una mejora significativa:
- de la cicatrización de las heridas [14],
- calidad y supervivencia de los injertos de grasa [15],
- de la restauración del cabello [16].
- y la calidad de la piel con un efecto antienvejecimiento [17].
Todas estas indicaciones requieren un aumento de
- la proliferación de los fibroblastos,
- de la producción de colágeno,
- Estimulación de células madre
- y el crecimiento de la angiogénesis.
Curiosamente, nuestros experimentos in vitro e in vivo han demostrado científicamente que el PRP mejora estos elementos regenerativos clave. Estos resultados apoyan nuestro tratamiento regenerativo diario con PRP en cirugía plástica y medicina estética, y demuestran el mecanismo de acción.
El dispositivo médico CuteCell ha sido diseñado y validado para el cultivo de células in vitro en condiciones autólogas que cumplen las directrices GMP y las normas de las agencias reguladoras.
CuteCell-PRP ha demostrado ser un complemento biológico eficaz, rentable y seguro para los cultivos de fibroblastos y células madre adiposas, así como un sustituto de los derivados sanguíneos xenogénicos o alogénicos para la validación de futuros protocolos de expansión celular clínica in vitro.
Hemos demostrado que los productos derivados de las plaquetas son biológicos autólogos que estimulan la angiogénesis in situ sin necesidad de injertar material exógeno prevascularizado.
El PRP y el PRP-HA fueron las únicas preparaciones que permitieron que tuviera lugar el proceso angiogénico completo.
Referencias
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