Un autre regard

 

Régénération de la peau avec le PRP-(HA) Projets suisses de recherche translationnelle, des expériences in vitro et in vivo aux preuves cliniques.

Dr Ali Modaressi, MD (1)

Sarah Berndt, PhD (2)

Dr Ali Modarressi MD et Dr Sarah Berndt, Ph D

1. Chirurgie plastique, reconstructive et esthétique, Genève (Suisse)

2. Docteur en sciences biomédicales et pharmaceutiques
Responsable de la recherche en thérapie cellulaire chez Regen Lab SA (Suisse)

1. La recherche sur la thérapie cellulaire :

La thérapie cellulaire vise à introduire de nouvelles cellules saines dans le corps d’un patient, pour remplacer les cellules endommagées.

  • Ce type de thérapie est un défi car il nécessite un nombre suffisant de cellules à transplanter chez le patient.
  • En effet, les cellules spécialisées, telles que les fibroblastes ou les cellules cérébrales, sont difficiles à obtenir à partir du corps humain.
  • De plus, les cellules spécialisées ont généralement une capacité limitée à se multiplier, ce qui rend difficile la production d’un nombre suffisant de cellules nécessaires à certaines thérapies cellulaires.

Certains de ces problèmes peuvent être résolus par l’utilisation de cellules souches.

  • Les cellules souches sont des cellules non spécialisées qui ont la capacité de se développer en d’autres types de cellules fonctionnelles.
  • Il est important de noter que certains types de cellules souches peuvent être cultivés en dehors du corps humain, ce qui permet la production d’un grand nombre de cellules nécessaires à la réussite des applications de la thérapie cellulaire en médecine.
  • Lorsqu’on utilise des cellules autologues, le patient est propriétaire de sa propre thérapie.

2. Démonstration de la sécurité et de l'efficacité dans les projets de recherche translationnelle : établissement de modèles de culture de cellules 100% autologues.

Ces dernières années, nous avons lancé un projet de recherche translationnelle qui a mis en évidence l’effet prolifératif du PRP obtenu à partir du sang du patient sur les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSC) et les fibroblastes du même patient [1-3] (Figure 1).

  • Notre objectif est d’être totalement autologue afin de proposer des thérapies personnalisées.
  • C’est pourquoi une gamme de dispositifs médicaux, CuteCell, dédiée à la culture in vitro de cellules humaines dans des laboratoires de recherche (installations GMP) a été développée.
  • Ces dispositifs permettent la préparation de PRP (CuteCell-PRP), de sérum (CuteCell-sérum) et de PRP enrichi en MNC (CuteCell-MNC).
  • Ces nouveaux produits offrent une alternative autologue au sérum bovin fœtal (FBS) dans les milieux de culture pour les thérapies cellulaires [4].
CUTE CELL

2.1 Cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSC)

Le PRP accélère l’expansion des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSC).

  • Afin de définir un système autologue pour la prolifération des ADSC, nous avons évalué l’efficacité du PRP autologue sur la prolifération des ADSC en comparaison avec le milieu classique supplémenté en FBS.
  • Nous avons étudié la concentration optimale de PRP dans les milieux de culture.
  • Les milieux de culture supplémentés avec 20% de PRP préparé à partir du sang du patient ont augmenté de 14 fois la prolifération in vitro des ADSC par rapport au milieu de culture classique préparé avec 10% de FBS pendant 10 jours [1] (Figure 2).

Figure 2 : Un milieu de culture complété par du PRP autologue augmente considérablement la prolifération in vitro par rapport à un milieu de culture classique contenant 10% de FBS. Données tirées de Atashi et al. Tissue Engineering. Part C. 2014 [1].

Le PRP ne modifie pas le phénotype des ADSC, leur capacité de différenciation et leur statut chromosomique.

  • Nous avons vérifié que le potentiel de différenciation intrinsèque des ADSC en adipocytes, ostéocytes ou chondrocytes était conservé intact, quels que soient les suppléments utilisés pour leur prolifération.
  • Nous avons observé que le PRP n’avait pas d’effet négatif sur la capacité de différenciation des ADSC.
  • Les potentiels de différenciation adipogénique, chondrogénique et ostéogénique ont été confirmés et étaient qualitativement comparables à ceux du FBS à 10% [1].
  • L’analyse cytogénétique des cellules cultivées dans des conditions de 10% de FBS ou de 20% de PRP n’a pas montré de caryotype anormal.
  • Les conditions de culture FBS et PRP présentaient une stabilité numérique et structurelle.

Ainsi, le traitement des cellules avec du PRP ne modifie pas la stabilité chromosomique [1].

2.2. Fibroblastes dermiques humains (NHDF) :

De nos jours, l’application de fibroblastes autologues pour la réparation de la peau présente un intérêt clinique important.

Dans la plupart des cas, la culture in vitro de cellules cutanées est obligatoire.

Cependant, l’expansion cellulaire à l’aide de milieux de culture xénogéniques ou allogéniques présente certains inconvénients, tels que le risque de transmission d’infections ou une expansion cellulaire lente.

2.2.1. Amélioration de l’expansion des fibroblastes grâce à un traitement par PRP autologue.

Dans cette étude, nous avons prélevé des fibroblastes et du sang sur les mêmes patients.

  • Après 7 jours de culture, les fibroblastes supplémentés avec différentes concentrations de PRP ont montré un nombre de cellules viables plus élevé par rapport aux milieux contenant du FBS (Figure 3).
  • Cet effet prolifératif du PRP a suivi une courbe en forme de cloche dose-dépendante.
  • La condition de culture optimale était le PRP 20% où le nombre de NHDFs était 7,7 fois plus élevé que le FBS 10% [2,3].

Figure 3 : Photographie optique en champ clair de NHDF en présence de FBS 10% ou de PRP (5-20%) après 7 jours de culture. Grossissement 10x. Les photos sont représentatives d’un seul donneur. Données de Berndt et al. Tissue Engineering. Part A. 2019 [3].

2.2.2. La concentration optimale de PRP est cruciale pour le maintien du phénotype des fibroblastes.
  • Les fibroblastes cultivés dans un milieu de culture classique supplémenté en FBS présentaient une forme cellulaire régulière et aplatie,
  • tandis que ceux traités avec du PRP (10-50 %) étaient fusiformes, une morphologie plus proche des cultures de matrice 3D ou du contexte in vivo.

Nous avons cherché à savoir si le changement morphologique survenant après 7 jours de traitement par PRP était lié à un changement phénotypique.

  • Nous avons d’abord démontré une réorganisation importante de la F-actine, passant de la localisation de l’actine corticale (FBS 10 %) à des filaments épais traversant les cellules (PRP 20 %).
  • Nous avons ensuite évalué les changements de l’expression d’alpha-SMA lors du traitement par PRP par cytométrie en flux et analyses immunofluorescentes.
  • L’expression d’alpha-SMA a augmenté de manière significative avec une concentration élevée de PRP (40-50%), tandis que les cellules traitées avec FBS-10% et PRP 5-10% ont montré une coloration périnucléaire basale.
  • L’analyse par immunofluorescence a montré une augmentation de la coloration de la vimentine en présence de PRP à 20 %, mais elle était complètement abolie à une concentration élevée de PRP (PRP à 50 %) [3].

Ces résultats soulignent l’importance d’une concentration optimale de PRP. Ils confirment qu’une concentration élevée de plaquettes n’est pas meilleure qu’une concentration modérée et pourrait même être nuisible [5,6].

2.2.3. Le PRP de CuteCell module l’activité métabolique, l’adhésion des fibroblastes et favorise la migration.

En utilisant un test métabolique MTT, nous avons mis en évidence une augmentation des cellules traitées par PRP.

Ce qui reflète directement une augmentation de l’activité métabolique des cellules, atteignant un pic de 3,12 fois dans les cellules traitées par PRP 20%, par rapport aux cellules traitées par FBS 10% après 48 h de traitement.

Pour caractériser davantage les effets biologiques du PRP sur la biologie des fibroblastes, nous avons évalué l’effet du traitement PRP sur l’adhésion des cellules à la laminine et au collagène de type I.

  • Le PRP a diminué l’attachement global des fibroblastes à la laminine 4 h après l’ensemencement.
  • Cet effet s’est produit déjà après 15 min, avec une diminution de 21% de l’adhésion globale des cellules.
  • Les mêmes résultats ont été obtenus pour l’attachement des fibroblastes à la matrice de collagène I (41% de l’adhésion cellulaire totale après 15 min).

Pour étudier les propriétés migratoires des fibroblastes exposés au PRP, nous avons réalisé un test de grattage in vitro (Figure 4).

  • Huit heures de traitement par 20% de PRP ont induit une augmentation de 10% du nombre de cellules migrant de la marge de grattage vers la zone de grattage par rapport aux cultures cellulaires avec FBS. Ce front de migration était une migration cellulaire collective.
  • À l’inverse, les fibroblastes exposés à 10 % de FBS présentaient des caractéristiques de migration cellulaire isolée [3].

Figure 4 : Effets cellulaires comparatifs du traitement par PRP 10% sur la migration cellulaire dans des cultures de fibroblastes. (A) Les fibroblastes en migration ont réduit la largeur de la zone de grattage, comme le montre une coloration par immunofluorescence à la phalloïdine après 8 heures. Le front de migration cellulaire est distribué de manière égale le long de la frontière de grattage dans le FBS 10%, alors qu’il est moins homogène dans les cellules traitées au PRP 10%. (B) Zoom sur les images montrant la migration cellulaire isolée dans les cultures FBS 10% et la migration cellulaire collective dans les cultures PRP 10%. Données de Berndt et al. Tissue Engineering. Part A. 2019 [3].

2.2.4.Analyse du génome entier pour démontrer que le PRP de CuteCell est sûr au niveau génomique.

Pour documenter la stabilité génétique pendant la prolifération, nous avons cultivé des NHDF pendant 4 jours avec des milieux supplémentés en FBS 10 % ou en PRP 10 %.

L’analyse CGH en réseau des cellules traitées avec les deux milieux de culture différents n’a pas montré de réarrangements chromosomiques déséquilibrés.

L’augmentation du taux de prolifération en réponse au traitement par PRP n’a pas provoqué d’instabilité génomique [3].

Ces résultats sont de première importance car certaines études affirment que les facteurs de croissance libérés par le PRP peuvent contribuer à la progression tumorale [7].

3. L'angiogenèse est modulée de manière différentielle par les préparations dérivées des plaquettes

Dans le cadre de la régénération tissulaire, l’angiogenèse thérapeutique vise à restaurer un système vasculaire approprié par l’administration de facteurs de croissance exogènes, de cytokines et de chimiokines, entre autres.

Les facteurs angiogéniques importants sont:

  • le VEGF,
  • l’angiopoïétine,
  • le FGF,
  • le HGF,
  • le PDGF
  • et le TGF
  • bien qu’une myriade d’autres protéines soient également connues pour être impliquées dans la formation des vaisseaux sanguins.

La libération de produits dérivés des plaquettes, tels que des facteurs de croissance autologues, des cytokines et des chimiokines, peut déclencher une angiogenèse thérapeutique.

Dans une étude in vitro, nous avons évalué et comparé la capacité de trois préparations dérivées de plaquettes :

  • le plasma riche en plaquettes (PRP),
  • l’acide hyaluronique du PRP (PRP-HA)
  • et les lysats de plaquettes (PL) à différentes concentrations (5-40%) pour moduler les effets biologiques des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) sur le métabolisme,
  • la viabilité,
  • la sénescence,
  • la sécrétion de facteurs angiogéniques
  • et les capacités angiogéniques en 2D (test de formation de tube endothélial ou EFTA)
  • et en 3D (test des billes de fibrine ou FBA) [8].
3.1. Le PRP et le PRP-HA modulent les activités angiogéniques des cellules endothéliales (HUVEC) en 3D.

Dans ce travail, nous avons utilisé un test d’angiogenèse 3D in vitro à haut débit (le fibrin bead assay ou FBA) pour modéliser l’effet angiogénique des préparations dérivées des plaquettes utilisées dans les études d’ingénierie tissulaire ou en clinique (Figure 5A).

  • Nous avons testé une gamme de concentrations (5 à 40 %) de PRP standardisé de CuteCell, CM-PRP-HA, obtenu avec le tube Cellular Matrix BCT-HA, et une préparation commerciale de lysats plaquettaires. Les échantillons de sang ont été obtenus à partir de donneurs sains.
  • La procédure était conforme aux principes de la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par la commission cantonale genevoise d’éthique et de recherche (ID 2017-00700, approuvée le 18 octobre 2018).
  • Le FBA utilise  une culture de cellules endothéliales (CE) à la surface de microsphères Cytodex-3 d’une taille de ~200 μm intégrées dans une matrice de fibrine bovine 3D, avec des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF) utilisés comme cellules nourricières.
  • Ces cellules stromales fournissent divers facteurs de croissance angiogéniques :
    • facteur de croissance des hépatocytes (HGF),
    • facteur de croissance transformant alpha (TGF-α),
    • angiopoïétine-1 (Ang-1),
    • ainsi que des molécules matricielles,
    • des protéines modifiant la matrice des protéines matricellulaires, par ex: 
      • procollagène C endopeptidase enhancer 1,
      • protéine sécrétée acide et riche en cystéine (SPARC),
      • protéine Ig-H3 induite par le facteur de croissance transformant-β (βIgH3)
      • et protéine 7 liant le facteur de croissance analogue à l’insuline (IGFBP7)). [9].

Dans les conditions de contrôle, la germination des néovaisseaux est apparente entre les jours 2 et 3, et les cultures sont imagées au jour 4.

  • Pour la quantification de la germination du réseau de microvaisseaux, les échantillons sont automatiquement scannés avec un imageur à haut débit et l’analyse des images de microsphères est effectuée en utilisant une méthode que nous avons développée avec le logiciel ImageJ (Figure 5B) [10,11].
  • Ce test représente une amélioration significative par rapport aux tests angiogéniques conventionnels à cellule unique, car l’inclusion de plusieurs types de cellules reproduit plus fidèlement l’environnement physiologique [9].
  • Les étapes fondamentales de l’angiogenèse par germination comprennent
    • la dégradation enzymatique de la membrane basale des capillaires,
    • la prolifération des cellules endothéliales (CE), la migration dirigée des CE,
    • la tubulogenèse (formation de tubes par les CE),
    • la fusion des vaisseaux,
    • l’élagage des vaisseaux
    • et la stabilisation des péricytes.

 

  • Les préparations dérivées des plaquettes provoquent différentes réponses angiogéniques lorsqu’elles sont testées dans le FBA où elles agissent sur différentes étapes du processus angiogénique.
  • Grâce à la puissante méthode de quantification automatique que nous avons développée [10], nous pouvons évaluer la modulation des paramètres morphométriques des néovaisseaux formés dans la matrice de fibrine.
  • Il s’agit par exemple de la longueur totale du réseau microvasculaire, des anastomoses dans les vaisseaux (branches), du nombre de capillaires issus des bourrelets (ancrage), et du nombre de pointes de vaisseaux montrant la complexité du réseau (extrémités) (Figure 5B).
  • Dans notre étude, les préparations les plus puissantes étaient le PRP et le CM-PRP-HA, car la longueur totale du réseau néovasculaire, la longueur totale des branches, des extrémités et de l’ancrage étaient fortement stimulées par rapport aux conditions de contrôle (VEGF+/traitement à l’héparine) (Figure 5C).

Les préparations de plaquettes ont stimulé toutes les étapes du processus angiogénique, la microscopie optique ayant permis d’observer la germination massive d’un réseau ramifié de microvaisseaux (Figure 5A).

Le PRP était la préparation angiogénique la plus puissante, stimulant significativement l’angiogenèse de 2 à 12 fois selon la concentration de PRP utilisée et le paramètre d’intérêt (Figure 5C).

  • Une angiogenèse significative était déjà observée avec la plus faible concentration de PRP (5 %).
  • Le CM-PRP-HA a également stimulé l’angiogenèse mais dans une moindre mesure que le PRP : cela peut s’expliquer par le fait que la concentration de plaquettes dans cette préparation est réduite de moitié par rapport au PRP.
  • Les lysats de plaquettes devaient être hautement concentrés pour provoquer la même réponse angiogénique que le PRP et le CM-PRP-HA [8].

Figure 5 : Les produits dérivés des plaquettes modulent différemment l’angiogenèse dans le test des billes de fibrine en 3D.

  • (A) Des cultures 3D de HUVEC ont été traitées avec des produits dérivés de plaquettes (PRP, PRP-HA et PL) à différentes concentrations pendant 4 jours. Images représentatives d’une augmentation massive de l’angiogenèse (PRP 20, PRP-HA 20) ou d’une légère prolifération endothéliale à partir des billes recouvertes de CE (PL20) par rapport aux conditions de contrôle (contrôle et héparine) au jour 4. Barre d’échelle : 150 μm.
  • (B) Images représentatives de l’angiogenèse améliorée. Perles de microcarrier Cytodex recouvertes de HUVECs présentant une croissance pseudo-capillaire après analyse automatique avec un plugin spécifique développé pour le logiciel Image J [11] ; certains des paramètres morphométriques d’intérêt sont indiqués. 
  • (C) La quantification des paramètres morphométriques du réseau capillaire a été réalisée par une méthode informatisée (grâce au logiciel opensource Image J) sur des photos prises au jour 4.
  • Les paramètres représentatifs mesurés étaient la longueur totale, la longueur totale des branches, le nombre d’extrémités et le nombre de jonctions d’ancrage par sphère.

Données de Berndt et al. Biomedicines. 2021 [8].

3.2. Effet sur la viabilité et la sénescence des HUVEC.

Pour évaluer la viabilité des cellules, nous avons ajouté du cristal violet comme colorant afin d’étudier l’effet des produits dérivés des plaquettes sur la viabilité des cellules (Figure 6C).

  • Après 3 jours de traitement, davantage de cellules violettes viables ont été trouvées dans les cultures traitées par PRP et PRP-HA.
  • Le PRP et le PRP-HA (10-40 %) ont augmenté la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante par rapport aux conditions de contrôle.
  • La PL a également augmenté la viabilité cellulaire mais dans une moindre mesure [8].
  • Pour évaluer l’effet des préparations dérivées des plaquettes sur la sénescence des HUVEC, nous avons induit un vieillissement in vitro en cultivant les cellules à une faible densité [12] des passages 2 à 6.
    • Le vieillissement in vitro induit une augmentation de la taille des cellules et de leurs noyaux, et davantage de cellules apoptotiques apparaissent [13].
    • Dans cet essai, nous avons testé 10% de FBS, 2UI/mL d’héparine, 10% de PRP, 10% de PRP-HA et 10% de PL.

La culture en série à long terme dans des milieux FBS ou héparine a induit des cellules sénescentes, alors qu’aucune cellule sénescente n’a été observée avec les traitements dérivés des plaquettes [8].

Figure 6 :

A. Viabilité des HUVEC évaluée par coloration au cristal violet dans des cultures témoins et dans des cultures traitées par PRP, PRP-HA et PL.

B. Quantification de la quantité de colorant libéré par mesure de l’absorbance (590 nm).

C. Coloration de la bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA–gal) des HUVEC (objectifs 20x) au passage 6 traitées avec du FBS, de l’héparine, 10 % de PRP, 10 % de PRP-HA ou 10 % de PL comme indiqué dans les figures.

Les cellules positives au bêta-gal apparaissent en bleu dans les conditions de culture avec FBS et héparine.

4.Conclusions

La médecine régénérative englobe un large éventail de techniques visant à réparer, voire à remplacer des tissus endommagés ou âgés. Parmi celles-ci, le plasma riche en plaquettes autologue est l’une des plus simples et des plus efficaces. Cette approche repose sur les capacités intrinsèques du corps humain à se réparer et sur le rôle des plaquettes dans ce processus.

L’utilisation du PRP standardisé, seul ou en combinaison, dans le cadre de la médecine régénérative suscite un intérêt croissant car il représente un traitement sûr et naturel, et il a démontré jusqu’à présent des résultats prometteurs dans de nombreuses indications thérapeutiques.

Dans des études cliniques, l’administration de PRP a montré une amélioration significative:

  • de la cicatrisation des plaies [14],
  • de la qualité et de la survie des greffes de graisse [15],
  • de la restauration des cheveux [16]
  • et de la qualité de la peau avec un effet anti-âge [17].

Toutes ces indications nécessitent une augmentation de

  • la prolifération des fibroblastes,
  • de la production de collagène,
  • de la stimulation des cellules souches
  • et de la croissance de l’angiogenèse.

Il est intéressant de noter que nos expériences in vitro et in vivo ont démontré scientifiquement que le PRP améliore ces éléments régénérateurs clés. Ces résultats soutiennent notre traitement régénérateur quotidien avec le PRP en chirurgie plastique et en médecine esthétique, et démontrent le mécanisme d’action.

Le dispositif médical CuteCell a été conçu et validé pour la culture cellulaire in vitro dans des conditions autologues qui respectent les directives GMP et les normes des agences réglementaires.

Il a été démontré que CuteCell-PRP est un complément biologique efficace, rentable et sûr pour les cultures de fibroblastes et de cellules souches adipeuses, ainsi qu’un substitut aux dérivés sanguins xénogéniques ou allogéniques pour la validation de futurs protocoles cliniques d’expansion cellulaire in vitro.

Nous avons montré que les produits dérivés des plaquettes sont des produits biologiques autologues qui stimulent l’angiogenèse in situ sans nécessiter de greffe de matériel exogène pré-vascularisé.

Le PRP et le PRP-HA ont été les seules préparations permettant la réalisation de l’ensemble du processus angiogénique.

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